福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

儲(chǔ)存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對(duì)于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2和1號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。
5. 換槍頭，從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。
6. 換槍頭，從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。
7. NC管中不加任何陽性對(duì)照。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個(gè)樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 86bp 的 DN段作為陽性對(duì)照。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

Phospho-Paxillin(Tyr31)  酸化樁蛋白Paxillin抗體大腸桿菌宿主殘留蛋白(E.coli P)ELISA試盒

Phospho-Paxillin(Ser83)  酸化樁蛋白Paxillin抗體 多黏類芽孢桿菌

Phospho-Paxillin(Ser178)  酸化樁蛋白Paxillin抗體 蘑菇假單胞菌

Phospho-Paxillin (Tyr118)  酸化樁蛋白Paxillin抗體 產(chǎn)假單胞菌

phospho-PARK2(Ser378)  酸化帕金蛋白抗體 橙色粘球菌

phospho-PARK2(Ser101)  酸化帕金蛋白抗體 黃色粘球菌

Phospho-PAR4 (Thr163)  酸化蛋白酶活化受體4抗體 弱小珊瑚桿菌

福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒phospho-PAK6(Ser165)  酸化P21蛋白激活的蛋白激酶6 葉柄粘球菌

Phospho-PAK4(Ser99)  酸化p21激活激酶4抗體 侵蝕侏儒囊菌

Phospho-PAK4(Ser474)/PAK5(Ser602)/PAK6(Ser560)  酸化p21激活激酶4/5/6抗體 變綠粘球菌

phospho-PAK3(Ser139)  酸化p21激活激酶3抗體 紫色孢囊桿菌

phospho-PAK2(Ser141)  酸化p21激活激酶2抗體 孢囊桿菌

Phospho-PAK2 (Ser20)  酸化p21激活激酶2抗體 匣狀粘球菌

phospho-PAK1+PAK2+PAK3 (Ser141)  酸化p21激活激酶1/2/3抗體 過渡原囊菌

phospho-PAK1/2/3(Thr423)  酸化p21激活激酶1/2/3抗體 酸梭菌難辨梭狀芽胞桿菌PCR檢測(cè)試盒 低溫運(yùn)輸，-20℃保存50T

萘酚 AS-TR 酸鹽Naphthol AS-TR Phosphate Disodium Salt-20℃保存25mg

萘啶酮酸Nalidixic Acid室溫干燥保存5g

耐熱型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(H-)Thermal Stable MMLV Reverse Transcriptase (H-)-20℃保存1000U

耐氧西林金黃色葡萄球菌PCR檢測(cè)試盒低溫運(yùn)輸，-20℃保存50T

木聚糖Xylan室溫干燥保存2.5g

木瓜特定基因序列PCR檢測(cè)試盒低溫運(yùn)輸，-20℃保存50T

木瓜蛋白酶抑制溶液，0.5 mg/mLPapain Inhibitor Solution-20℃保存10mL

木瓜蛋白酶Papain4℃保存5g

木瓜PCR檢測(cè)試盒低溫運(yùn)輸，-20℃保存50T